Mój świat pojedynczych cząsteczek

Stany wzbudzone cząsteczek – profesor Jacek Waluk w rozmowie z Izabelą Blimel do książki pt. Mistrzowie Nauki  

 Prof. dr hab. Jacek Waluk, Instytut Chemii Fizycznej PAN: Od ponad trzydziestu lat zajmuję się stanami wzbudzonymi cząsteczek. I do dziś jest to dla mnie niezwykle fascynujące. Stany wzbudzone to takie, w których cząsteczki mają więcej energii niż zazwyczaj. I tak na przykład kiedy patrzymy na świecącą żarówkę, to wewnątrz niej znajdują się właśnie atomy w stanach wzbudzonych, które oddają energię w postaci światła. Poza tym cząsteczki w stanach wzbudzonych różnią się pod wieloma względami od tych w stanie podstawowym. I kiedy rozumie się, co się dzieje w stanach wzbudzonych cząsteczek, to można tę wiedzę przekuć na zastosowania. Dlatego w Instytucie zajmujemy się głównie badaniami podstawowymi, ponieważ tak naprawdę to badania podstawowe skutkują zastosowaniami. Nie istnieje odkrycie na zamówienie – to błąd w założeniu. Kiedy Hertz odkrył fale elektromagnetyczne, nie zastanawiał się, czy znajdą one zastosowanie. Również kiedy wykryto pierwiastki promieniotwórcze, to nie przewidywano ich wykorzystania w radioterapii.

Przeniesienie protonu

W obszarze badań podstawowych zajmujemy się przeniesieniem protonu, kolokwialnie rzecz ujmując – najprostszą reakcją chemiczną typu kwas-zasada. Przed laty naukowcom to zjawisko wydawało się proste, ale dziś okazuje się, że jest inaczej (to, co wydawało nam się oczywiste, nie do końca jest dziś prawdą, a w niektórych przypadkach jest nawet nieprawdą). I tak, proces przeniesienia protonu uważano za najprostszą reakcję chemiczną. Jednak jeśli się jej przyjrzymy, okazuje się, że jest to najbardziej skomplikowana reakcja. Dlaczego? Bo proton, który się przenosi od  kwasu do zasady jest najlżejszym jądrem, czyli jest najlżejszą cząstką, która bierze udział w reakcji chemicznej (oczywiście poza elektronem) . A jeśli występuje coś tak lekkiego, to opis ruchu takiego obiektu  wymaga uwzględnienia zasad fizyki kwantowej, a nie klasycznej. I jeśli mamy do czynienia z protonem kwantowym, to nie zawsze on zachowuje się jak piłeczka, która odbija się od ściany – czasami zachowuje się jak piłeczka, która przez tę ścianę przenika. To zjawisko nazywa się tunelowaniem. Prowadzone od kilkunastu lat badania naszego zespołu sugerują, że ruch protonów nie jest zwykłym przesunięciem w przestrzeni. Protony zmieniają położenie dzięki kwantowemu efektowi tunelowania: korzystając z zasady nieoznaczoności znikają w jednym miejscu i pojawiają się w drugim.

Tunelowanie

Zjawiskiem tunelowania zajmujemy się w Instytucie od wielu lat. Kiedy rozpoczynałem prace nad układami, które badam do dziś, publikacje na ten temat mówiły, że jeśli pomiar odbywa się w temperaturze znacznie niższej niż temperatura otoczenia, to należy uwzględnić tak zwaną poprawkę na tunelowanie. Dziś wiemy, że mechanizm jest jednak inny. Pokazujemy, że tunelowanie, które kiedyś było uważne za jakiś egzotyczny efekt i należało je uwzględniać jedynie w bardzo specyficznych warunkach, jest tak naprawdę w wielu przypadkach dominujące. Występuje nawet w temperaturze pokojowej i wyższych. I w zasadzie nie mamy podstaw, aby sądzić, że tak się nie dzieje w wielu innych układach. Naukowcy uciekali od tunelowania, ponieważ jest ono bardzo trudne do opisu teoretycznego. My pokazujemy, że tunelowanie występuje, ale zrozumienie tego zjawiska wymaga jeszcze ogromnego wysiłku. Dlatego przez najbliższe lata chcemy się tym zajmować i wykorzystać fakt, że można je obserwować. Efekt, który był uznawany przez fizyków i chemików za egzotyczny, dziś wydaje się być bardzo rozpowszechnionym zjawiskiem .

Wodór w cząsteczkach – jednak tuneluje?

Porfiryna i jej pochodne to związki występujące naturalnie w przyrodzie. Wykryto je m.in. w ludzkiej krwi, gdzie pełnią ważną rolę biologiczną: uczestniczą w reakcjach związanych z transportem tlenu. W naszym Instytucie od kilkunastu lat badamy pochodne porfiryny. Cząsteczki te mają postać płaskich pierścieni węglowych z atomami wodoru na zewnątrz i czterema atomami azotu wewnątrz. W centrum cząsteczki, w pustej przestrzeni otoczonej czterema atomami azotu, znajdują się dwa atomy wodoru. Wykazują one ciekawą cechę: mogą się przemieszczać między atomami azotu. Staraliśmy się poznać dokładny przebieg tego zjawiska i wyjaśnić mechanizmy odpowiedzialne za jego istnienie. Czy atomy wodoru przemieszczają się klasycznie, jak w typowej chemii, czy też za ich ruch odpowiada tunelowanie, efekt kwantowy pozwalający pokonywać bariery potencjału bez konieczności zdobywania dodatkowej energii?

W środowisku chemików tunelowanie traktowano początkowo jako zjawisko rzadkie, zdarzające się tylko w wyrafinowanych warunkach. Dziś staje się oczywiste, że to proces powszechny, zachodzący podczas większości – jeśli nie wszystkich – reakcji chemicznych z udziałem wodoru. Przypuszcza się, że tunelowanie odgrywa istotną rolę podczas przenoszenia wodoru w enzymach, gdzie prawdopodobnie dochodzi do synchronicznego tunelowania kilku protonów jednocześnie. Podobne mechanizmy mogą mieć znaczenie przy powstawaniu mutacji DNA. W naszym Instytucie szukamy wskazówek dotyczących natury procesu transportu atomów wodoru w pochodnych porfiryny. Wykorzystano w tym celu cząsteczki zmodyfikowane w taki sposób, że potencjał elektryczny, w którym się przemieszczały, był lekko niesymetryczny: jedna z barier studni potencjału była nieco niższa od drugiej. Opis teoretyczny zjawiska przewiduje, że gdyby atomy wodoru przemieszczały się w sposób klasyczny, po prostu przechodząc nad barierą, stała szybkości tej reakcji powinna się zwiększać. Pomiary przeprowadzone we współpracy z Wydziałem Fizyki Uniwersytetu Warszawskiego wskazują na istnienie efektu przeciwnego: zmniejszenia stałej szybkości. Rezultat ten jest dobrze tłumaczony przez teorię zakładającą, że głównym mechanizmem odpowiedzialnym za przemieszczanie atomów wodoru w cząsteczce jest tunelowanie. Wyniki, otrzymane przez naszą grupę dzięki badaniom niesymetrycznych pochodnych porfiryny, nie są jeszcze ostatecznymi dowodami. Możemy jednak mówić już o dobrze udokumentowanych przypuszczeniach, że nawet w temperaturze pokojowej ruch protonów w pochodnych porfiryny odbywa się na zasadzie tunelowania. Pytanie, czy tunelują całe atomy wodoru, czy same protony, wzbudza wiele emocji w środowisku naukowym. Atom wodoru składa się z protonu i elektronu. Gdy wodór staje się fragmentem cząsteczki, elektron ten dołącza do jej chmury elektronowej, która pełni rolę kleju zespalającego tworzące cząsteczkę jądra atomowe. Tunelowanie samego protonu oznaczałoby, że gęstość elektronów w chmurze po zakończeniu procesu pozostałaby niezmieniona. Gdyby tunelował cały atom wodoru, elektron powinien podążyć za protonem. Podział nie jest w rzeczywistości tak jednoznaczny i gdy proton tuneluje w cząsteczce, zwykle podąża za nim tylko część gęstości elektronu w chmurze. Najnowsze wyniki badań nad tunelowaniem protonów w pochodnych porfiryny współgrają z wcześniejszymi pracami, prowadzonymi w naszym instytucie nad cząsteczkami o potencjale symetrycznym. Kilka lat temu wykazaliśmy, że w zależności od stanu oscylacyjnego cząsteczki porficenu, tunelowanie może przebiegać szybciej lub wolniej. Do śledzenia tunelowania wykorzystano wtedy techniki laserowe. Pokazaliśmy, że zachowanie wodoru tunelującego w porficenie ma istotny wpływ na czas trwania fluorescencji, czyli emisji światła przez wzbudzoną cząsteczkę. W temperaturze pokojowej w roztworach o dużej lepkości czas zaniku fluorescencji wydłużał się nawet tysiąckrotnie: z pikosekund do nanosekund. W połączeniu z modelowaniem teoretycznym pomiary te pozwoliły odkryć, że gdy przenosi się jeden proton, energia cząsteczki się zmienia i ta musi odpowiednio zmodyfikować swoją strukturę, natomiast, gdy tunelują dwa protony jednocześnie, energia pozostaje niezmieniona. Atomy w cząsteczce nie muszą się wtedy reorganizować i tunelowanie staje się łatwiejsze. Badania nad tunelowaniem protonów mogą prowadzić nie tylko do lepszego zrozumienia procesów zachodzących w cząsteczkach, ale również do praktycznych zastosowań. Wzbudzone cząsteczki porficenu można byłoby stosować jako sondy do pomiaru lepkości w mikro- i nanoskali. Pozwalałaby one obserwować wybrane części komórek oraz wykrywać ich niektóre stany chorobowe. Z uwagi na silną zależność własności fotofizycznych od lepkości roztworu, opisane przez naszych naukowców odmiany porfiryny otwierają także interesujące możliwości selektywnego niszczenia komórek nowotworowych za pomocą terapii fotodynamicznych.

Zabijamy komórki nowotworowe i bakterie światłem

Robimy coś takiego, co może być zastosowane natychmiast – zabijamy komórki nowotworowe i bakterie światłem. Polega to na wykorzystywaniu tzw. tlenu singletowego w organizmach żywych. Kiedy tlen zostanie wzbudzony, to staje się straszliwie „żarłoczny”. I zjada wszystko, co znajduje się dokoła. Zależy nam na tym, aby tlen zjadł komórki nowotworowe, a nie inne. I okazuje się, że to działa. Chodzi nam także o to, aby tlen singletowy powstawał w komórce nowotworowej, a nie obok niej. Nazywa się to fotodynamiczną terapią, która ma już powszechne zastosowanie do usuwania pewnych zaburzeń skórnych. W tym przypadku jest to dość proste działanie, ponieważ po posmarowaniu zmian skórnych maścią, wykonuje się miejscowe naświetlenie. Natomiast powstaje pytanie, czy można tę metodę stosować w sposób bardziej wyrafinowany? Na przykład wewnątrz organizmu? Jedna z moich koleżanek podczas niedawnej konferencji dowiedziała się, że naukowcy wymyślili tzw. świecące mikrokapsułki, które po połknięciu uruchamiają wewnątrz organizmu fototerapię i zabijają bakterie powodujące wrzody żołądka. Bakterie te produkują pochodną porfiryny, czyli substancji, która bardzo silnie absorbuje światło czerwone. Następnie substancja ta przechodzi do stanu wzbudzonego, który chętnie uaktywnia tlen. To oznacza, że stan wzbudzony porfiryny oddaje swoją energię cząsteczce tlenu, cząsteczka tlenu przechodzi do singletowego stanu wzbudzonego i niczym „nienasycony agresor” niszczy wszystko naokoło. 

Dlaczego badanie pojedynczych cząsteczek jest takie ważne?

Bo nagle pokazuje, jak bogaty jest świat na poziomie pojedynczych cząsteczek. Jeszcze trzydzieści lat temu gdyby ktoś powiedział mi, że obserwuje pojedyncze cząsteczki, to nie do końca bym w to uwierzył. Ale dwadzieścia kilka lat temu pojawił się człowiek, Michel Orrit, który twierdził, że potrafi oglądać fluorescencję z pojedynczych cząsteczek i to wówczas wydawało się bardzo dziwne. Na początku obserwacja pojedynczych cząsteczek była domeną fizyków, ponieważ wymagała użycia wysoko wyspecjalizowanych technik. Minęło kilka lat i okazało się, że pojedyncze cząsteczki można oglądać w temperaturze pokojowej, w foliach polimerowych. Kładziemy przezroczystą folię polimerową pod mikroskopem i nagle objawiają nam się w niej pojedyncze cząsteczki jako świecące punkciki. W Instytucie potrafimy obserwować, jak się poruszają. Wewnątrz każdej cząsteczki znajdują się dwa protony, które przemieszczają się tam i z powrotem. Śledząc ich ruch możemy obserwować reakcję chemiczną w pojedynczej cząsteczce – i to już jest coś niezwykłego.  

Po co obserwuje się pojedyncze cząsteczki?

To jest podstawowe pytanie. Chemicy, badając absorpcję danej molekuły tak naprawdę wyciągają średnią z tego, jak zachowuje się miliard miliardów cząsteczek. I teraz jest dylemat, czy badać zbiór miliona cząsteczek przez sześćdziesiąt sekund, czy obserwować zachowanie pojedynczej cząsteczki przez sześćdziesiąt milionów sekund? Wynalezione niedawno techniki badania pojedynczych molekuł pozwalają nam patrzeć na cząsteczki i widzieć je takimi, jakimi one naprawdę są. Aczkolwiek każda cząsteczka jest trochę inna, to w większości zachowują się podobnie. Kilka lat temu na podstawie badań pojedynczych cząsteczek opublikowaliśmy pracę, w której mój kolega zbadał około 900 cząsteczek, czyli musiał 900 razy zarejestrować zachowanie pojedynczej cząsteczki pod mikroskopem. I okazało się, że na podstawie badań cząsteczek w roztworach dla większości z nich wynik był bliski średniej, ale dla pięciu procent cząsteczek wyniki były zupełnie inne. Co oznacza, że otrzymaliśmy populację cząsteczek, która stanowi elitę. W naszym przypadku, co było jeszcze ciekawsze, obserwowaliśmy populację cząsteczek, które przez jakiś czas odstawały od średniej, a następnie zachowywały się, jak cząsteczki uśrednione. O co chodziło?

Potrafiliśmy obserwować, jak szybko przenoszą się protony. I tą średnią wartość otrzymywaliśmy dotąd z badań  ogromnej liczby cząsteczek, a tutaj patrzyliśmy na pierwszą, drugą, pięćdziesiątą, setną, itd. cząsteczkę. I obserwowaliśmy, jak one się zachowują. Wyniki były zaskakujące, gdyż nagle cząsteczka stawała się absolutnie niereaktywna, podczas kiedy inne były aktywne. W badaniach klasycznych nie moglibyśmy tego zjawiska zaobserwować, bo dziewięćdziesiąt pięć procent cząsteczek zachowuje się tak samo, a tylko pięć procent zachowuje się w sposób nietypowy.

Dlaczego tak jest?

Sądzimy, że te cząsteczki znalazły się w otoczeniu, które blokuje reakcję chemiczną. To otoczenie wolno fluktuuje  – jest to polimer, który w temperaturze pokojowej dosyć wolno się relaksuje i co jakiś czas otoczenie pojedynczej cząsteczki staje się nieprzyjazne dla tej cząsteczki. I wtedy reakcja zwalnia w sposób drastyczny z powodu niewystępowania tunelowania. Jest to proces, w którym stosunkowo małe zmiany zewnętrzne potrafią zmienić charakter całego zjawiska, tzw. klasycznej reakcji chemicznej. W tunelowaniu to może zająć sekundę, albo cały wiek, w zależności od otoczenia. Tunelowanie potrafi nam zmienić reakcje chemiczne. I patrząc na pojedyncze cząsteczki jesteśmy w stanie takie efekty uchwycić. Jest to badanie pojedynczych cząsteczek techniką fluorescencji – obserwujemy, jak cząsteczka świeci. Ale okazuje się, ze można to robić jeszcze ciekawiej, a mianowicie można na pojedynczych cząsteczkach mierzyć widma oscylacyjne, czyli obserwować drgania cząsteczki. Należy dodać, iż cząsteczka drga na kilkadziesiąt sposobów – im więcej atomów, tym więcej sposobów drgań. Jedną z metod obserwacji drgań cząsteczek jest rejestracja widma rozpraszania promieniowania – tzw. widma ramanowskiego. Znajomość drgań jest bardzo ważna, ponieważ stanowią one tzw. „dowód osobisty” danej cząsteczki. Tak naprawdę każda cząsteczka ma inny zespół drgań. Jeśli mamy dwie cząsteczki i trudno je rozpoznać, to pomiar za pomocą widma ramanowskiego pozwala nam na ich rozróżnienie. Technikę tę zapoczątkował Chandrasekhara Venkata Raman na Uniwersytecie w Kalkucie. W 1930 roku otrzymał nagrodę Nobla za prace nad rozpraszaniem światła i odkrycie zjawiska, które nazwane zostało jego nazwiskiem. Do dziś widma ramanowskie stanowią niezwykle atrakcyjną metodę dla naukowców. I choć efekt Ramana był powszechnie badany w laboratoriach, to uchodził za niezbyt łatwy do zastosowania ze względu na małą intensywność światła rozpraszanego. Z czasem okazało się, że widmo ramanowskie można wzmacniać milion, a nawet miliard razy.

Jak wzmacnia się widmo ramanowskie?

Kiedy położymy cząsteczkę na nanocząstkach złota, to nagle staje się ona bardzo aktywna. I wtedy można badać nawet pojedyncze molekuły w widmach ramanowskich. To jest niezwykłe. Jak już wspomniałem, cząsteczki drgają na różne sposoby – i te drgania mówią nam po pierwsze o tym, czym jest cząsteczka, po drugie, jak cząsteczka jest zorientowana wobec nas, a po trzecie mówią nam o tym, w jakim otoczeniu się znajduje, w sposób niezwykle szczegółowy. Obserwując, jak zmieniają się drgania, uzyskujemy mnóstwo informacji, które trzeba zrozumieć. I obecnie tym właśnie się zajmujemy. Potrafimy rejestrować widma z pojedynczych cząsteczek całkiem szybko. Pojedyncza cząsteczka żyje w naszych warunkach kilka minut, otrzymujemy z niej kilka tysięcy widm. Obserwujemy, jak one ewoluują w czasie. Pod pewnymi względami są podobne, a pod pewnymi się różnią. Wiemy, jak taka cząsteczka się zachowuje, ale nie wiemy dlaczego tak się zachowuje. I dlatego próbujemy dociec, co nam Stwórca usiłuje przez to powiedzieć. Staramy się te badania rozwijać, choć jesteśmy daleko od odpowiedzi na pytanie, co dzieje się z daną cząsteczką. Jest to ważne w kontekście zastosowań. Jeśli potrafimy wykrywać pojedyncze cząsteczki, to właściwie osiągnęliśmy ostateczną granicę chemii analitycznej, tylko że musimy jeszcze wiedzieć, gdzie ta pojedyncza cząsteczka się znajduje. Czyli tak naprawdę chodzi o to, żeby pojedyncza cząsteczka znalazła się tam, gdzie na nią czyhamy z mikroskopem. A to już jest naprawdę trudne.